Bereits vor mehr als 4000 Jahren lief durch das Gebiet des heutigen Ortes Karlshöfen eine wichtige Nord-Süd-Verbindung, nämlich der Heerweg von der Nordseeküste bei Wremen nach Zeven. Davon zeugen u.a. Bohlenwege und Wagenteile, darunter eines der ältesten erhaltenen Wagenräder in Europa (im Hannoverschen Landesmuseum).

Der Ort selber wird vermutlich in der sächsich-karolingischen Zeit entstanden sein, worauf auch der Name schließen lässt. Im 12. bzw. 13. Jahrhundert entstand südwestlich von Karlshöfen eine Seeburg, die bis zum 15. Jahrhundert Bestand hatte. Heute weist auf diese Anlage eine Gedenktafel hin. 1857 wurde im Bereich des Karlshöfenerberges die Glasfabrik zur Carlshütte ( später Hansahütte und heute Brillantleuchten AG ) gegründet. Mitte des 19. Jahrhunderts entstand im südlichen Bereich der Gemeinde Karlshöfen die Moorsiedlung Karlshöfenermoor, die sich nicht als geplante Kolonie entwickelte.